目的与意义 运用流式细胞术和新型膜渗透性DNA荧光染色剂SYBR-14从人类睾丸中分离单倍体的精子细胞，并构建精子细胞的cDNA文库，以此来研究人类精子形成的表达谱。为高通量发现和寻找精子形成相关的新基因，阐明精子形成的分子机制以及寻找基因治疗精子形成障碍、免疫避孕、免疫性不孕的诊断新靶位点提供基础。 材料与方法 标本为成人正常的睾丸。利用物理方法和酶消化制成单细胞悬液；运用改良的非连续Percoll(15％、22％、30％、40％)密度梯度离心，对精子细胞进行初步的纯化及富集；取22％密度层细胞利用流式细胞术对精子细胞进行进一步的分选，根据细胞物理参数FSC(forward angle light scatter)、SSC(90°light scatter)从细胞形态和质地进行分选；再采用SYBR-14／PI荧光染色，通过DNA荧光染色强度差别进行分选。所分选的精子细胞进行巴氏染色细胞形态学分析、荧光原位杂交(nuoresce in situ hybridization，FISH，X／Y混合探针)和PI染色后DNA含量检测。所获取的细胞采用SMART(Switch Mechanism At the 5’end ofRNA Templates)技术建立eDNA文库。 结果 经改良的非连续percoll(15％、22％、30％、40％)密度梯度离心和流式细胞术分选出高纯度的精子细胞，利用细胞形态学、荧光原位杂交(FISH)、DNA含量分析进行检测，显示其纯度>90％。分选细胞的SYBR-14的荧光强度显示为单一峰，但CV>0.08。用所分选的细胞采用SMART技术构建精子细胞cDNA文库，原始文库滴度为1.65x10<´6>pfu／ml，重组率为93.27％，扩增文库滴度为1.1x10<´9>pfu／ml，插入片段大小在0.5-2.0Kb之间，平均长度为1.0Kb。在所构建的成人精子细胞cDNA文库中成功扩增出精子细胞阶段特异性表达的PRM2。 结论：1．从成人正常睾丸中利用流式细胞术分离出纯度为92.16％的精子细胞。2．验证了一种新型的膜渗透性DNA荧光染色剂SYBR-14能够大致反映细胞的DNA含量。3．成功构建了精子细胞的cDNA文库。
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